新乡生物切片的长期保存需要注意哪些事项？如何防止染色褪色？

生物切片的长期保存和染色稳定性是显微镜观察和科研存档的关键环节。若保存不当，切片可能出现褪色、霉变、脆化或结构变形，导致样本信息丢失。以下新乡生物切片制作厂家从保存环境、切片处理、染色保护、定期维护四大方面，结合具体措施和原理，系统阐述如何实现生物切片的长期保存并防止染色褪色。

一、保存环境控制：隔绝光、湿、氧与微生物

1. 避光保存

原理：光线（尤其是紫外线和可见光）会激发染料分子中的电子跃迁，导致共轭双键断裂或氧化，使颜色逐渐褪去。例如，苏木精-伊红（H&E）染色中的伊红在光照下易分解为无色化合物。

操作要点：

使用不透光容器：将切片存放在棕色玻璃瓶或金属盒中，避免塑料容器因透光性导致内部光线累积。

暗室或避光柜：若需长期展示切片，可将其置于带遮光帘的展示柜中，或使用UV过滤膜覆盖光源。

电子显微镜切片：超薄切片（如铜网支撑）需用铝箔包裹，防止电子束或环境光照射。

2. 干燥与低湿环境

原理：高湿度会促进微生物生长（如霉菌、细菌），同时加速染料水解和氧化。例如，甲苯胺蓝染色在湿度>70%时，2周内即可出现明显褪色。

操作要点：

干燥剂除湿：在切片盒中放置硅胶颗粒或无水氯化钙，定期更换（每3个月检查一次，变色即更换）。

密封保存：使用带硅胶密封圈的切片盒，避免空气流通导致湿度波动。

恒温恒湿柜：对珍贵切片（如病理档案样本），可存放在温度20-25℃、湿度40%-50%的恒温恒湿柜中。

3. 隔绝氧气

原理：氧气会参与染料的氧化反应，导致颜色变浅或偏移。例如，吉姆萨染色中的亚甲蓝在氧气作用下可被氧化为天青B，使染色结果偏蓝。

操作要点：

真空封装：将切片与干燥剂一起放入真空袋中，用抽气泵排除空气后密封。

惰性气体保护：对超薄电子显微镜切片，可在氮气或氩气氛围中保存，减少氧化反应。

4. 防微生物污染

原理：霉菌和细菌会分泌酶类分解染料，同时产生酸性代谢物腐蚀切片。例如，黑曲霉可分泌纤维素酶，破坏植物细胞壁结构。

操作要点：

灭菌处理：保存前用75%乙醇擦拭切片盒内部，或用紫外线照射（30分钟）杀灭表面微生物。

防霉剂添加：在干燥剂中混入0.1%硫代硫酸钠或对羟基苯甲酸酯，抑制霉菌生长。

定期检查：每6个月检查切片表面是否有霉斑或异味，发现污染立即隔离处理。

二、切片处理优化：增强结构稳定性与染料结合力

1. 彻底固定与硬化组织

原理：固定不足的组织在保存过程中易发生自溶或酶解，导致结构松散和染料脱落。例如，未充分固定的脑组织在保存1年后可能出现神经元胞体塌陷。

操作要点：

延长固定时间：对大块组织（如肝脏、肾脏），固定时间延长至48-72小时，确保固定剂渗透至组织中心。

后固定处理：光学显微镜切片可用1%锇酸后固定2小时，增强细胞膜和细胞器的稳定性；电子显微镜切片需用2%戊二醛固定4小时以上。

硬化剂使用：对柔软组织（如肠黏膜、肺泡），可在固定液中加入1%醋酸或0.1%铬酸，促进蛋白质交联硬化。

2. 优化包埋与切片支持

原理：包埋介质可保护组织免受物理损伤，同时减少染料迁移。例如，石蜡包埋的切片在保存10年后仍可保持H&E染色清晰度，而未包埋的冰冻切片在1年内即出现严重褪色。

操作要点：

切片后立即用丙酮固定10分钟，再浸入70%乙醇中保存，减少冰晶形成导致的结构损伤。

对需长期保存的冰冻切片，可转移至石蜡包埋后再保存。

电子显微镜样本用Epon 812或Spurr树脂包埋，固化后硬度达HRC 80-90，可长期抵御机械磨损。

树脂中可加入0.5%苯醌作为耐氧化剂，延缓染料氧化。

选择低熔点石蜡（56-58℃），避免高温导致组织收缩。

包埋后冷却至室温，再置于4℃保存，减少石蜡脆化。

石蜡包埋：

树脂包埋：

冰冻切片保护：

3. 封片剂选择与使用

原理：封片剂可隔绝空气和水分，同时固定染料分子。例如，中性树胶封片的切片在保存20年后仍可清晰观察，而未封片的切片在5年内即出现严重褪色。

操作要点：

滴加封片剂后，用盖玻片轻轻覆盖，避免气泡产生。

封片后置于水平台上自然干燥24小时，确保封片剂完全固化。

对荧光切片，封片后需用铝箔包裹，避光保存。

光学显微镜：用中性树胶或DPX（Distrene Polystyrene Xylene）封片，后者透光性更优且不易发黄。

荧光显微镜：用耐荧光淬灭封片剂（如ProLong Gold），含甘油和耐氧化剂，可延长荧光信号保留时间至1年以上。

电子显微镜：超薄切片无需封片，但需用碳涂层（厚度10-20纳米）增强导电性并保护铜网。

封片剂类型：

封片操作：

三、染色保护：选择稳定染料与优化染色工艺

1. 选用耐光染料

原理：不同染料的光稳定性差异显著。例如，苏木精在光照下易褪色，而刚果红可耐受光照数年无明显变化。

操作要点：

对需长期保存的切片，优先选择金属复合染料（如银染、铁苏木精），其金属离子可增强染料稳定性。

对荧光切片，改用时间分辨荧光（TRF）技术，使用镧系元素（如铕、铽）作为标记物，其荧光寿命长且耐光漂白能力强。

高稳定性：刚果红、甲苯胺蓝、阿尔辛蓝（Alcian blue）。

中稳定性：苏木精、伊红、吉姆萨染色中的亚甲蓝。

低稳定性：荧光染料（如DAPI、FITC）、PAS染色中的Schiff试剂。

光稳定性分级：

替代方案：

2. 优化染色工艺

原理：染色时间、温度和pH值会影响染料与组织的结合强度。例如，H&E染色中伊红过染会导致染料易脱落，而不足则颜色偏淡。

操作要点：

对银染切片，染色后用5%硫代硫酸钠固定1分钟，防止银颗粒氧化脱落。

对铁苏木精染色，染色后用饱和铁明矾处理2分钟，增强染料与组织的结合力。

分化与返蓝：苏木精染色后用1%盐酸乙醇分化5-10秒，再用氨水返蓝1分钟，增强细胞核与细胞质的对比度。

固定染色：对易褪色染料（如伊红），染色后用95%乙醇固定1分钟，再浸入二甲苯透明化。

苏木精染色：时间控制在5-10分钟，温度室温，pH值2.5-3.0（用醋酸调节）。

伊红染色：时间1-3分钟，温度室温，pH值4.5-5.0（用碳酸氢钠调节）。

标准化染色流程：

后处理强化：

金属盐处理：

3. 耐氧化剂添加

原理：耐氧化剂可中和自由基，延缓染料氧化。例如，在封片剂中加入0.1%维生素E可使荧光切片的光稳定性提高3倍。

操作要点：

染色液中添加：在伊红染色液中加入0.01%没食子酸丙酯，可减少光照导致的褪色。

封片剂中添加：在DPX封片剂中混入0.5%丁基羟基茴香醚（BHA），可延长切片保存时间至10年以上。

储存液中添加：对需长期保存的染色液（如吉姆萨染色原液），加入0.02%硫代硫酸钠作为稳定剂。

四、定期维护与质量监控

1. 定期检查与记录

原理：通过定期观察切片状态，可及时发现褪色、霉变或脆化问题，并采取补救措施。

操作要点：

颜色变化：对比初始染色照片，记录褪色程度（如使用色差仪测量ΔE值）。

结构完整性：检查组织是否有裂纹、脱落或霉斑。

封片状态：观察封片剂是否开裂或发黄。

普通切片：每1-2年检查一次。

珍贵切片（如病理档案、模式生物突变体）：每6个月检查一次。

检查频率：

检查内容：

记录管理：建立切片档案，记录保存条件（温度、湿度、光照）、检查日期和问题处理措施。

2. 褪色切片的修复

原理：轻微褪色的切片可通过重新染色或补色恢复观察效果，但严重褪色的切片需重新制作。

操作要点：

对无法修复的切片，用显微镜扫描仪生成高分辨率数字图像（如40×物镜，分辨率0.1微米/像素），建立电子档案库。

对局部褪色的切片，可用微喷笔蘸取稀释染料（如1%伊红）轻轻补色，再封片保存。

用二甲苯浸泡切片10分钟，溶解封片剂后取出盖玻片。

将切片浸入70%乙醇中洗去二甲苯，再重新进行染色和封片。

脱封与复染：

补色处理：

数字化备份：

五、特殊切片保存注意事项

1. 荧光切片

避光要求：荧光信号随时间自然衰减，需严格避光保存。

低温保存：封片后置于-20℃冰箱，可延长荧光寿命至1年以上（室温下仅能保存1-2周）。

耐淬灭剂：使用含甘油和耐氧化剂的封片剂（如ProLong Gold），可减缓光漂白速度。

2. 电子显微镜切片

防氧化处理：超薄切片需用碳涂层或铂涂层保护，避免铜网氧化导致导电性下降。

干燥保存：切片需完全干燥后再保存，避免水分导致铜网腐蚀或树脂膨胀。

真空封装：将铜网放入真空盒中，减少氧气接触。

3. 冰冻切片

短期保存：未固定的冰冻切片可置于-80℃冰箱，保存不超过1个月。

长期保存：需转移至石蜡包埋或树脂包埋后再保存，避免冰晶反复冻融导致结构损伤。

结论

生物切片的长期保存和染色稳定性需通过环境控制（避光、干燥、低湿、防氧）、切片处理（固定、包埋、封片）、染色优化（耐光染料、耐氧化剂、标准化工艺）和定期维护（检查、修复、数字化）的综合措施实现。对特殊切片（如荧光、电子显微镜、冰冻切片），需采用针对性方法（如低温避光、碳涂层、石蜡转移）。通过系统化管理，可确保切片保存数十年甚至更久，为科研和临床提供可靠的历史数据支持。